文章中使用的單細(xì)胞建庫平臺為墨卓生物的MobiNova?-100，該平臺的亮點(diǎn)之一：6 min完成核酸捕獲，最大程度減少RNA降解。借助該平臺，經(jīng)流式分選的細(xì)胞依然能被高效的捕獲，同時(shí)獲得高質(zhì)量的數(shù)據(jù)，墨卓平臺的省時(shí)特性給予該應(yīng)用場景以充分保障。

慢性肝損傷引起的肝纖維化和肝硬化是世界重大健康疾病之一。肝纖維化是以細(xì)胞外基質(zhì)（EMC）過度沉積為特征的慢性肝損傷結(jié)果，能形成有利于肝癌發(fā)展的微環(huán)境。目前針對纖維化的臨床干預(yù)和治療有限，以細(xì)胞治療為代表的替代治療方案開發(fā)成為重要的方向之一。根據(jù)研究顯示，單核吞噬細(xì)胞巨噬細(xì)胞在肝纖維化的進(jìn)展和消退中具有雙重作用，以巨噬細(xì)胞為導(dǎo)向的細(xì)胞治療已經(jīng)在小鼠肝纖維化模型和臨床試驗(yàn)中開展測試。

1.uPAR 為靶標(biāo)的 CAR-Ms技術(shù)開發(fā)

細(xì)胞衰老和肝星狀細(xì)胞增殖減少可能在 ECM 降解中發(fā)揮著作用。之前的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)uPAR是衰老過程中廣泛誘導(dǎo)的細(xì)胞表面蛋白，并證明抗uPAR 的CAR-T細(xì)胞對肝纖維化具有活性。該研究在更大規(guī)模的肝纖維化或肝硬化患者群體中證實(shí)了這一發(fā)現(xiàn)，表明uPAR是一種在肝纖維化過程中過度表達(dá)的細(xì)胞表面蛋白，是一種潛在的治療干預(yù)靶標(biāo)。

接下來，該研究構(gòu)建了由抗小鼠uPAR的第一代CAR，并轉(zhuǎn)導(dǎo)了小鼠骨髓源性巨噬細(xì)胞 (BMDM) CAR-Ms。腺病毒感染后，通過流式細(xì)胞術(shù)測量了巨噬細(xì)胞 CAR 表達(dá)（圖 1A和1B），結(jié)果表明 CAR-Ms 在體外具有依賴 uPAR 的吞噬作用。

圖 1

2.CAR-Ms技術(shù)可以改善肝功能

1）CAR-Ms 減輕毒素引起的肝纖維化

該研究測定了 uPAR CAR-Ms 在毒素（反復(fù)注射 CCl4）誘導(dǎo)的纖維化小鼠體內(nèi)的抗纖維化功效。結(jié)果表明，與 PBS 組相比，BMDMs 能顯著減少 ECM 沉積，這與已發(fā)表的結(jié)果一致。與靶向活性和治療效果相一致的是，接受 CAR-Ms 治療的小鼠血清中肝臟酶 ALT 水平降低，表明促炎性衰老造血干細(xì)胞被有效清除，肝損傷減輕。天狼星紅染色，α-SMA 以及 desmin 分析進(jìn)一步證實(shí)，反復(fù)注射 CCl4 組的肝纖維化有所緩解（圖2）。

圖 2

2）CAR-Ms 定位于肝臟并在體內(nèi)發(fā)揮功能

為了評估uPAR CAR-Ms在體內(nèi)的療效，用抗uPAR染色了由CCl4誘導(dǎo)的纖維化小鼠經(jīng)CAR-Ms處理后的肝臟切片（圖3A）。組織學(xué)分析表明，輸注了uPAR CAR-Ms的纖維化小鼠肝臟中的uPAR陽性區(qū)域明顯減少（圖3B）。實(shí)驗(yàn)證明uPAR CAR-Ms 可在體內(nèi)消除靶細(xì)胞，從而緩解肝纖維化。

圖3

3）CAR-Ms 改善纖維化小鼠的肝功能

由于被招募的巨噬細(xì)胞在協(xié)調(diào)肝臟修復(fù)和再生方面發(fā)揮著至關(guān)重要的作用，猜測可以使用表達(dá) CAR 的外源性體外分化巨噬細(xì)胞來改善肝功能。因此，該研究試圖評估 uPAR CAR-Ms 能否恢復(fù)纖維化小鼠的肝功能。通過對 CCl4 誘導(dǎo)的肝纖維化小鼠模型研究，與對照組相比，接受 BMDMs、Mock-BMDMs 或 uPAR CAR-Ms 治療的纖維化小鼠肝細(xì)胞生長因子（Hgf）的 mRNA 水平有顯著增加（圖 4A）。此外，與其他組相比，CAR-Ms 受體小鼠的血清白蛋白也有所增加（圖 4B）。因此，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)用 CAR-Ms 處理會誘導(dǎo)肝細(xì)胞增殖，Ki67 表達(dá)顯示了這一點(diǎn)（圖 4C）。這些結(jié)果表明，CAR-Ms療法能促進(jìn)纖維化小鼠肝細(xì)胞的增殖和肝功能的恢復(fù)。

圖4

3.CAR-Ms技術(shù)的機(jī)制解析

為了進(jìn)一步了解 CAR-Ms 誘導(dǎo)的細(xì)胞變化，該研究對從注射生理鹽水、BMDMs 或 CAR-Ms 的纖維化小鼠肝臟中收集的 FACS 分選單細(xì)胞進(jìn)行了 RNA-seq（圖 5A）。細(xì)胞輸注七天后，用流式細(xì)胞術(shù)分離出所有白細(xì)胞（CD45⁺），并對它們進(jìn)行 MOBINOVA-100 單細(xì)胞 RNA 測序（scRNA-seq）（圖 5A）。對 9,394 個白細(xì)胞進(jìn)行了 scRNA-seq 分析，確定了不同的白細(xì)胞群，包括 Ly6c^hi 巨噬細(xì)胞、Ly6c^lo 巨噬細(xì)胞、pDCs、cDC2s、cDC1s、ILC1s、中性粒細(xì)胞、循環(huán) T 細(xì)胞、NK 細(xì)胞、B 細(xì)胞和 T 細(xì)胞（圖 5B）。對小鼠肝臟 T 細(xì)胞進(jìn)行亞聚類分析，發(fā)現(xiàn)了六個定義明確的亞群，這些亞群是根據(jù)已發(fā)表的特征和細(xì)胞標(biāo)記進(jìn)行注釋的（圖 5C）。對照組小鼠和接受 CAR-Ms 治療的小鼠的 T 細(xì)胞區(qū)系的整體組織顯示出驚人的差異。scRNA-seq 數(shù)據(jù)顯示，接受 CAR-Ms 治療的纖維化小鼠細(xì)胞毒性 CD8⁺T 細(xì)胞顯著增加（圖 5D）。這些數(shù)據(jù)表明循環(huán) T 細(xì)胞發(fā)生了顯著變化，這些細(xì)胞被定性為具有細(xì)胞毒性的循環(huán)效應(yīng) CD8⁺T 細(xì)胞?？傊?，scRNA-seq 分析證實(shí)了CAR-Ms 療法不僅通過直接消滅 uPAR+ 肝星狀細(xì)胞，還通過改善肝臟微環(huán)境和產(chǎn)生疫苗效應(yīng)來減輕肝纖維化。

圖5

CAR-Ms 的過繼轉(zhuǎn)移導(dǎo)致肝纖維化小鼠模型中肝纖維化顯著減少和功能恢復(fù)。CAR-Ms 調(diào)節(jié)肝臟免疫微環(huán)境以募集和修飾內(nèi)源性免疫細(xì)胞的活化以驅(qū)動纖維化的消退。這些CAR-M能夠募集抗原并將其呈遞給T細(xì)胞，并產(chǎn)生特異性的抗纖維化T細(xì)胞反應(yīng)，以減少小鼠的成纖維細(xì)胞和肝纖維化。總之，該研究證明了使用靶向uPAR的CAR 巨噬細(xì)胞 (CAR-Ms)可以減輕肝纖維化和肝硬化，論證了使用巨噬細(xì)胞作為CAR技術(shù)平臺的潛力，為肝纖維化患者提供更高效的治療策略，值得進(jìn)一步臨床驗(yàn)證。